Western blot là gì

Western Blot là một trong nghệ thuật đối chiếu được thực hiện rộng thoải mái nhằm mục đích phân phát hiện những protein chăm biệt bên trên những chủng loại mô tuyệt dịch triết xuất mô.Quý khách hàng đã xem: Western blot là gì

Pmùi hương pháp này thực hiện năng lượng điện di trên gel nhằm phân tách bóc các protein còn nguim vẹn bởi cấu tạo 3 chiều tốt protein vẫn trở nên tính theo độ dài của mạch polypeptide. Protein này tiếp nối sẽ tiến hành chuyển lên màng (hay sử dụng là màng nitrocelluthua trận giỏi màng PVDF), sinh hoạt kia chúng được gắn bằng những kháng thể quánh hiệu với protein mục tiêu. Điện di trên gel sẽ được đưa vào hệ thống so với Western Blot nhằm mục tiêu giải quyết và xử lý những vụ việc của các bội phản ứng chéo thân những chống thể.

Bạn đang xem: Western blot là gì


*

Nguồn ảnh: http://proteomics.case.edu/proteomics/westernblot.html

1. Nguim lý

Western Blot là kỹ thuật lai thân protein cùng với protein (Kháng nguim – Kháng thể). Protein phòng nguyên được vạc hiện qua bội phản ứng tạo nên color hoặc vạc huỳnh quang

2. Các bước thực hiện:

Bước 1: Xử lý mẫu

Lấy chủng loại tự toàn cục mô tốt môi trường xung quanh nuôi ghép tế bào. Đầu tiên, xử lý tế bào rắn bởi phương pháp cơ học sử dụng thiết bị xay, áp dụng sản phẩm đồng bộ hoặc cực kỳ âm. Những mẫu mã virut giỏi chủng loại đem trừ vào môi trường xung quanh nuôi cấy cũng rất có thể là mối cung cấp protein xác định được trong Western Blot. Thêm các nhiều loại hóa học tẩy rửa, muối với hỗn hợp đệm để ly giải tế bào với tổng hợp protein

Cách 2: Điện di bên trên gel

Điện di bên trên gel nhằm phân bóc tách các protein trong chủng loại. Sự phân bóc này của protein dựa trên điểm đẳng năng lượng điện, trọng lượng phân tử, điện tích hoặc phối kết hợp các nguyên tố trên.

Pmùi hương pháp năng lượng điện di phổ cập nhất là điện di trên gel polyacrylamide với gồm bổ sung sodium dodecyl sulfate (SDS). Phương pháp SDS – PAGE (năng lượng điện di bên trên gel polyacrylamide với có bổ sung SDS) giữ lại những polypeptide sinh hoạt tinh thần đổi mới tính sau thời điểm bọn chúng được xử trí với chất khử bạo dạn với mất đi cấu trúc bậc 2, cấu tạo bậc 3.

Bước 3: Chuyển protein gel lên màng lai

Để những protein rất có thể phát hiện nay được kháng thể thì protein phải được gửi trường đoản cú gel lên màng lai. Phương thơm pháp chủ yếu để đưa các protein được Gọi là phương pháp thẩm tách điện là thực hiện một loại năng lượng điện nhằm kéo những protein trường đoản cú gel lên màng PVDF hoặc màng nitrocelluthất bại. Các protein được chuyển lên màng mà vẫn gia hạn sự thu xếp nlỗi trên bản gel. Kết trái là protein sẽ tiến hành ptương đối ra bên trên lớp mỏng dính bề mặt nhằm thực hiện xác định

Cách 4: Xử lý màng lai (Blocking)

Do chống thể và protein đích các là protein, yêu cầu thường thực hiện các bước nhằm ngăn chặn liên kết giữa màng với chống thể được áp dụng để xác định protein kim chỉ nam. Việc ngăn chặn những links ko đặc hiệu bằng phương pháp đặt màng vào hỗn hợp protein loãng albumin huyết tương trườn 3-5 % (BSA) hoặc sữa bột không to trong Tris – Buffered saline (TBS). Protein trong hỗn hợp loãng vẫn gắn với màng ở toàn bộ những vị trí cơ mà protein đích chưa đã nhập vào. Do đó Khi phòng thể được bổ sung cập nhật vào, đã không thể khu vực bám trên màng xung quanh những địa chỉ links quánh hiệu với protein đích. Điều này có tác dụng bớt nhiễu cơ bản trong sản phẩm sau cuối của Western Blot, mang đến kết quả rõ ràng và ngoài hiện tượng dương tính mang.

Xem thêm: " Sổ Cái Tiếng Anh Là Gì ? Mẫu Sổ Cái ( Tiếng Anh) Theo Tt200/2014/Tt

Bước 5: Quá trình lai cùng vạc hiện tại vị trí lai

Để vạc hiện nay những protein chăm biệt, màng được dò protein quan tâm bởi chống thể đã đổi khác có tác dụng link cùng với enzyme thông tin, enzyme này Khi kết phù hợp với một cơ hóa học tương ứng sẽ liên hệ phản ứng kêt nạp quang với sản xuất color. Quá trình này ra mắt gồm 2 bước:

- Màng lai đã cố định và thắt chặt protein được lai cùng với kháng thể sơ cấp cho. Kháng thể sơ cấp cho là 1 trong những phòng thể đặc hiệu được tao ra Lúc đến đồ vật nhà giỏi môi trường thiên nhiên nuôi cấy tế bào miễn kháng tiếp xúc với protein quan tâm.

- Sau Khi rửa màng nhằm vứt bỏ phòng thể sơ cấp cho chưa link, màng tiếp tục lắp chống thể thứ hai (phòng thể vật dụng cấp) có thêm enzyme (thường áp dụng horseradish peroxidase). Tiếp tục ủ màng lai vào một tất cả hổn hợp bội nghịch ứng quánh hiệu với enzyme. Đặt một tấm phyên ổn ngạy cảm với tia X lên màng lai nhằm phân phát hiện những đặc điểm phân phát ra do enzyme.

Có thể thực hiện các phương pháp nhằm phân phát hiện tại phòng thể đồ vật cấp: sử dụng phản xạ mặt trời ngay sát liên kết cùng với kháng thể gắn thêm chất huỳnh quang đãng, thực hiện đánh dấu phóng xạ

3. Ứng dụng:

Tiencookieofficial)

ThS. Đỗ Thị Phượng Linh

Tài liệu tsi khảo

Olga Lucia Morales, 2002. Identification of Toxocara canis antiren by Western Blot in experimentally infected rabbits. Rev. Inst. Med.trop. S. Paulo 44 (4):213 – 216.